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多药耐药(MDR)常源于长期化疗，表现为恶性肿瘤对多种结构与作用机制各异的化疗药物产生交叉耐药，导致治疗效果下降、疾病复发风险攀升。这一复杂现象由药物外排增强、代谢改变、细胞自噬及DNA损伤修复能力提升等因素共同驱动，其中，P-糖蛋白(P-gp)介导的药物外排因明确的药理学及结构特征，成为攻克MDR的关键靶点。
基于前期发现的 6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉骨架新型P-gp抑制剂，本研究通过靶向结构优化，以3,4-二甲氧基苯乙胺为底物合成中间体f和g，经系列修饰获得42种目标化合物，并深入分析构效关系。最终，化合物41脱颖而出，经流式细胞术、平板法等多维度实验证实，其能有效抑制P-gp功能逆转耐药，为肿瘤化疗增敏开辟新路径。
以3,4-二甲氧基苯乙胺为起始原料，通过缩合、取代、还原胺化等多步反应合成42种新型目标化合物(图1、图2)。所有化合物结构经¹H NMR、¹³C NMR和HRMS确证，均为首次报道。
图1.化合物1-22的合成
图2.化合物23-42的合成
生物筛选与构效关系
通过CCK-8法评估化合物对Eca109/VCR细胞的毒性及逆转长春新碱(VCR)耐药的活性。结果显示：
低细胞毒性：除化合物2(细胞存活率 55.4%)外，其余化合物均适合与抗肿瘤药物联用。
高效逆转活性：化合物41逆转倍数(RF)达467.7，为最优活性化合物。
构效关系规律：
1.苄基苯环3、4位取代基空间位阻与电性显著影响活性：
a.卤素取代(23-25)、长链烷基(28、31)、大环烷基(32-34)及磺酰基(35-42)均能增强逆转活性；
b.苯基引入需合适碳链连接基，否则活性降低(如26、27)；双键(29)或醚键(30)不利于逆转活性。
2.4位取代整体优于3位，即使3位不利基团(如2-氟苯基、噻吩基)在4位取代时仍表现出显著活性(38、40)。
图3.构效关系总结
1）诱导细胞凋亡：
单药VCR组凋亡率极低，化合物41联合VCR后凋亡率呈剂量依赖性升高，5μM联合组凋亡率较单药组提升3倍以上，接近阳性对照TQ 水平(图4、图5)。
图4.流式检测细胞凋亡情况
图5.细胞凋亡差异
流式支持：
该实验使用的层浪生物流式细胞仪 LongCyte®，具备卓越性能与便捷操作体验。支持多达3激光14色，拥有26种光学配置，可灵活满足多样化实验需求。半导体激光器、光纤传导以及恒温控制技术，确保了光路检测的高度稳定性。此外，仪器标配自动进样器，能适配96孔板(U、V、平底)、流式管、EP管等多种样本容器，还支持体积法及微球法绝对计数，为本次实验数据的精准获取提供了有力保障 。
平板克隆实验显示，单独使用41或VCR以及低浓度的41联合VCR对耐药细胞克隆形成无显著影响；2.0μM 联合VCR用药组克隆数较单药组减少70%以上，证实其协同杀伤作用(图 6)。
图6.平板克隆实验结果
免疫印迹结果显示，耐药株P-gp表达显著高于亲本株，但化合物41及阳性对照均未改变P-gp蛋白水平，提示其作用于P-gp功能而非表达(图7、图8)。
图7-8.P-gp 蛋白表达分析
荧光底物罗丹明123(RH123)和 Hoechst 33342蓄积实验表明，化合物41可显著提升耐药细胞内荧光强度，证实其通过阻断P-gp的ATP依赖外排功能恢复药物浓度(图9、图10)。
图9-10.荧光底物蓄积实验
对P-gp特异性底物(秋水仙碱、多西他赛)逆转活性显著(RF分别为19.67、113.1)，对非P-gp底物(拉帕替尼)无逆转作用，验证其靶向P-gp的机制(图11)。
图11.不同化疗药物的逆转倍数对比
本研究通过系统性结构优化，开发出高效 P-gp 抑制剂化合物 41，其逆转多药耐药的能力显著优于第三代抑制剂 TQ。机制研究表明，该化合物通过非竞争性结合 P-gp 抑制药物外排，且不影响其表达水平。研究结果为基于四氢异喹啉骨架的肿瘤化疗增敏剂开发提供了新方向，有望为临床克服多药耐药提供潜在候选药物。
参考文献：
Design, Synthesis, and Biological Activity Study of 6,7-Dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline Derivatives Against Multidrug Resistance in Eca109/VCR Cells
