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本文提出了一种创新的纳米囊泡（NVs）策略，用于增强三阴性乳腺癌（TNBC）免疫治疗的疗效。其中流式细胞术被用于多个关键实验，各实验详细如下：
验证VSVG修饰的纳米囊泡（V-NVs/T+A）是否增强肿瘤细胞的摄取。
用荧光标记（如GFP-VSVG和RFP-TNF-α）的V-NVs/T+A处理4T1和3T3细胞，通过流式检测荧光强分析4T1和3T3细胞NVs/T+A和V-NVs/T+A的细胞摄取情况（图1）。
图1
荧光强度对比：V-NVs/T+A组的荧光强度显著高于未修饰组（NVs/T+A），表明VSVG促进膜融合，提升内化效率。
时间依赖性：荧光强度随时间增加，说明摄取是动态过程。
细胞选择性：V-NVs/T+A在4T1（同源肿瘤细胞）中的荧光强度高于3T3（异源细胞），显示同源靶向性。
评估V-NVs/T+A对免疫微环境的重编程作用。
标记：CD45+（白细胞）、CD11c+（DCs标志）、CD80+/CD86+（成熟DCs）。
实验结果：V-NVs/T+A组CD80+CD86+ DCs比例显著升高（图2,3），表明TNF-α和VSVG协同促进抗原提呈。
图2
图3
标记：
● M1型（促炎）——CD45+CD11b+F4/80+CD80+。
● M2型（抑炎）——CD45+CD11b+F4/80+CD206+。
实验结果：V-NVs/T+A组M1型比例增加（图4,5），M2型减少（图6），显示免疫微环境从抑炎向促炎转变。
图4
图5
图6
CD8+ T细胞：CD45+CD3+CD8+
实验结果：V-NVs/T+A组浸润增加2.04倍（图7,8），表明细胞毒性免疫应答增强。
图7
图8
Tregs：CD45+CD3+CD4+Foxp3+
实验结果：V-NVs/T+A组减少54%（图9），表明免疫抑制被逆转。
图9
验证TNF-α诱导的凋亡及VSVG/A23187的协同作用。
Annexin V-FITC/PI双染法检测4T1细胞凋亡。
V-NVs/T+A组凋亡率最高，加入TNF-α抑制剂（Z-VAD-FMK）后凋亡减少（图10,11），证实TNF-α依赖的凋亡途径。
图10
图11
为了进一步验证TNF-α依赖的凋亡的具体路径，WB实验补充了caspase-3的检测，结果显示TNF-α通过激活caspase-3诱导凋亡（图12）。
图12
验证A23187通过升高Ca²⁺促进EVs分泌。
Fura-2 AM探针标记细胞内Ca²⁺，流式检测荧光强度。
Ca²⁺水平：Fura-2 AM检测显示A23187（钙离子载体）组细胞内Ca²⁺显著升高（图13）。
图13
分析全身免疫激活状态。
流式分析CD8+T细胞中TNF-α与IFN-γ的水平。
CD8+T细胞中TNF-α+和IFN-γ+的水平显著升高（图14），这与V-NVs/T+A联合治疗促进的抗肿瘤反应增强趋势一致。该结果表明TNF-α在肿瘤微环境中实现了有效递送与渗透，从而进一步放大了V-NVs/T+A疗法的抗肿瘤功效。
图14
多参数免疫表型分析：通过多色流式同时检测DCs、巨噬细胞、T细胞等亚群，全面评估免疫微环境重塑。
机制验证：
使用抑制剂（如Z-VAD-FMK、BAPTA）明确TNF-α和Ca²⁺的作用。
通过膜融合（VSVG）和内吞抑制实验阐明摄取机制。
体内-体外结合：流式数据与体内疗效（肿瘤抑制、肺转移减少）相互印证，增强结论可靠性。
流式实验在本文中系统验证了V-NVs/T+A的细胞摄取、免疫激活及凋亡诱导机制，核心结论包括：
VSVG促进膜融合，增强肿瘤细胞特异性摄取。
23187通过Ca²⁺途径促进EVs分泌，实现TNF-α的深层递送。
免疫微环境重塑：DCs成熟、M1巨噬细胞极化、CD8+ T细胞浸润增加，Tregs减少。
协同效应：VSVG（膜融合）+ A23187（EVs分泌）+ TNF-α（凋亡/免疫激活）联合作用显著抑制肿瘤生长和转移。
这些数据为“冷肿瘤”免疫治疗提供了实验依据，突出了工程化纳米囊泡的多功能协同作用。
本文中的所有流式数据均由层浪生物Longcyte®流式细胞仪获取。
