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流式细胞术做为一种快速的细胞定量分析技术，能够同时对单个细胞进行多种特征参数的检测，如细胞大小、DNA含量、蛋白质表达等，现已成为科研领域中不可或缺的重要工具。
而流式检测能顺利进行的硬要求之一是，样本必须能在鞘液中流动，因此，无论是培养的细胞，还是从各种组织中提取出来的细胞，都需要把待测样本制备成单细胞悬液！制备欠妥的样本，不仅会直接影响实验的准确性和结果的可靠性，一些大的细胞团块甚至会堵塞液流系统而影响仪器的正常运行。
层浪技术宝典第二期，为更好地掌握流式检测的样本制备环节，给大家带来了小鼠淋巴组织单细胞悬液制备的全流程。希望你不管是实验“小白”还是有经验的研究者，都可以能从中受益，轻松搞定实验！
Phase.1 实验过程
1取脾脏：
①颈椎脱臼法处死小鼠（图A）；在解剖台上固定小鼠，从底端小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；
②剪开小鼠腹膜，暴露出脾脏，摘取，并充分去除上面的脂肪组织（图C、图D）；
③将取下的脾脏置于预冷的PBS中浸泡待用。
2研磨制备单细胞：
将脾脏置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎脾脏组织，脾脏细胞和红细胞通过筛网过滤至PBS中；脾脏充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
3裂解红细胞：
①在离心后的细胞悬液中加入1mL ACK红细胞裂解液，重悬细胞，在室温裂解5min；
②裂解结束后，加入5mL 含2% FCS的RPMI培养基终止裂解，涡旋混匀；
4过滤、洗涤：
通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
5单细胞计数：
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。
1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；
2.摘取脾脏后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高脾脏细胞的占比；
3.建议使用新鲜配制的红细胞裂解液。
Phase.2 流式结果
小鼠脾脏中Th17细胞检测分析：
① 通过FSC-H/SSC-H圈出淋巴细胞主群（图A）；
② 通过CD3圈出总的T细胞：CD3+（图B）；
③ 通过CD4/CD8圈出杀伤性T细胞（TCL）：CD3+CD4-CD8+；辅助性T细胞（Th）：CD3+CD4+CD8-（图C）；
④ 在Th细胞群中，进一步圈出Th17细胞：CD3+CD4+CD8-IL-17A+（图D）。
Phase.1 实验过程
1取淋巴结：
① 颈椎脱臼法处死小鼠（图A）；在解剖台上固定小鼠，从底端四肢剪开皮肤，小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；
② 小鼠淋巴结主要分布在：腹股沟左右两侧（图C）、腋窝（上箭头）和肱（下箭头）淋巴结的位置（图D）；下颌骨（上方箭头）、腋窝（中间箭头）和臂部（底部箭头）淋巴结的位置（图E）；左侧淋巴结位置在图示箭头处（图F），摘取下来淋巴结如图G所示；
③ 将取下的淋巴结置于预冷的PBS中浸泡待用；
2研磨制备单细胞：
将淋巴结置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎，淋巴结细胞通过筛网过滤至PBS中；淋巴结充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL 离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
3过滤、洗涤：
通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
4单细胞计数：
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。
1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；
2.摘取淋巴结后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高淋巴结细胞的占比。
Phase.2 流式结果
小鼠淋巴结中Tfh细胞检测分析：
①通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞主群（图A.R1）；
②用FCS-A/FCS-H去除粘连体信号，分析单细胞（图A.R2）
③圈出活性的T细胞：LD/B220-CD3+（图A.R3 ），在T细胞中圈出CD3+CD4+的细胞群（图A.R4）；
④通过共表达高水平的CXCR5和PD1来鉴定Tfh细胞（图B）；
⑤Tfh细胞高表达CD44和CXCR5（图C.左），并且转录因子Bcl6高表达（图C.右）。
Phase.1 实验过程
1取胸腺：
① 颈椎脱臼法处死小鼠，在解剖台上固定小鼠（图A）；小心剪开小鼠整个腹部皮肤，暴露出小鼠腹膜（图B）；
② 切除腹壁；小心地切开隔膜（如箭头所示），而不损伤血管、肝脏或胆囊（图C）；
③ 在不损害血管、肝脏、肺或心脏的情况下切除胸腔，暴露胸腺；胸腺用箭头标记（图D）；
④ 将胸腺置于预冷的PBS中浸泡待用；
2研磨制备单细胞：
将胸腺置于在70μm筛网上，使用研磨棒轻柔碾碎，胸腺细胞通过筛网过滤至PBS中；胸腺充分研磨之后，收集筛网下端溶液至50mL 离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
3过滤、洗涤：
通过70μm过滤网过滤，将过滤后的细胞悬液收集至离心管中，在4℃条件下，300g离心5min，去除上清液；
4单细胞计数：
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL，吸取100μL细胞悬液至流式管中，准备染色。
1.研磨力度尽量轻柔，避免造成过多机械性死亡的细胞；
2.摘取胸腺后，尽可能移除黏连的脂肪组织，提高胸腺细胞的占比；
3.摘取过程中，避免手术器械破坏胸腺附近的血管；若胸腺上有大量血液残留，可用PBS冲洗1-2次后再进行单细胞悬液制备。
Phase.2 流式结果
小鼠胸腺中Treg细胞检测分析：
①通过FSC/SSC特性圈出淋巴细胞（G0）(图A)；
②在淋巴细胞群（G0）中，通过FSC-A/FSC-H(图B)和SSC-A/SSC-W（图C）排除粘连体；使用死活染料圈出活细胞群体（G3）（图D）；
③在活细胞中，圈出CD4+CD8-细胞群（图E.G4）；随后展示FOXP3和CD25表达情况，区分两群Treg前体细胞（图F.G5&G6）和Treg细胞（图F.G7）；
④胸腺Treg细胞可分为CD24highCD69+的未成熟细胞（图G.G9）；和CD24dim/lowCD69-的成熟细胞（图G.G8）；
⑤CD4SP细胞也可分为CD24highCD69+的未成熟细胞（图H.G10）和CD24dim/lowCD69-的成熟细胞（图H.G11）。
